Ісаак Мазепа народився 16 серпня (28 серпня за новим стилем) 1884 року в селі Костобобрів Новгород-Сіверського повіту Чернігівської губернії (нині село Семенівської громади Новгород-Сіверського району). Він належав до багатодітної родини міщан козацького походження. Батько був працьовитим господарем, мав міцне господарство. Хазяйнувати йому допомагав старший брат Ісаака – Карпо. Родина підтримувала жагу Ісаака до знань і забезпечила йому навчання у Новгород-Сіверській бурсі, а пізніше – у Чернігівській духовній семінарії.
  У період навчання в Чернігові Ісаак Мазепа ознайомився з творами видатних соціалістичних теоретиків, таких як Карл Маркс, Фрідріх Енгельс, Карл Каутський, і став прихильником соціал-демократичних ідей. Це привернуло до нього увагу товаришів, і в подальшому Ісаак Прохорович швидко здобув репутацію соціал-демократа.
  У 1904 році Ісаак Мазепа вступив на факультет природничих наук Санкт-Петербурзького імператорського університету. Попри успіхи у навчанні юнак стикався зі значними матеріальними труднощами. Навіть після того як йому були надані деякі фінансові дотації від Товариства допомоги студентам з України, яке оплачувало навчання, Ісаак усе ще мав проблеми із забезпеченням свого прожиття. Він змушений був працювати репетитором у дітей із заможних родин.
  Іще будучи студентом, Ісаак Мазепа приєднався до Української соціал-демократичної робітничої партії в Санкт-Петербурзі. Це була організація, яка прагнула залучити українських працівників до боротьби за соціальні та політичні права. Під час свого членства в партії Мазепа познайомився з такими відомими українськими діячами, як Микола Порш, Симон Петлюра та ін.
  У 1907 році Ісаак Мазепа був делегований від Санкт-Петербурзької організації на з'їзд Української соціал-демократичної робітничої партії в Києві, що свідчить про його активну участь у роботі партії і визнання внеску в її діяльність. Після з'їзду від ЦК партії Ісаак Прохорович отримав завдання проводити агітаційно-пропагандистську роботу серед населення Полтавської губернії. Невдовзі поліція вийшла на слід "підбурювача", але Мазепа діяв під псевдонімом і це врятувало його від арешту. Переконавшись у небезпечності перебування в Україні, Ісаак Мазепа знову повернувся до університету.
  Паралельно з активною громадською діяльністю Ісаак Прохорович приділяв значну увагу своєму загальноосвітньому розвитку. Ісаак Мазепа систематично відвідував лекції не тільки зі своєї майбутньої професії, а й з історії, філософії, правознавства та економічних наук. Це допомогло сформувати його світогляд і глибше розуміти суспільно-політичні реалії тогочасності.
  Після закінчення навчання в університеті в 1910 році Ісаак Мазепа разом із групою молодих агрономів був відряджений Санкт-Петербурзьким міністерством хліборобства до країн Європи для вивчення передового досвіду в сільському господарстві. Ця поїздка надала йому цінні знання та ідеї щодо сільського господарства, які Ісаак Прохорович у подальшому використав на користь українського села.
  З 1912 до 1914 року Ісаак Мазепа працював у Нижегородському губерніальному земстві. Проте з початком Першої світової війни він вирішив повернутися до України.
  У 1915 році Ісаак Прохорович приєднався до Катеринославського губернського земства, де працював на посаді агронома у відділі, що забезпечував постачання армії.
  Після утворення Української Центральної Ради (УЦР) Ісаак Мазепа активно займався політичною діяльністю на Катеринославщині. Він спрямовував зусилля на залучення українських політичних партій до проведення губернського національного з'їзду. Цей з'їзд підтримав вимоги УЦР щодо національно-територіальної автономії України та обрав губернську Українську Раду.
  На той час Катеринослав був переважно російськомовним містом, і українські політичні партії мали обмежені можливості для своєї діяльності. Проте Мазепа активно діяв з підтримкою лише однієї української газети "Просвіта". Його зусилля спрямовувалися на зміцнення української свідомості й національного руху серед українського населення міста.
  Після приходу до влади більшовиків Ісаак Мазепа залишився в Катеринославі, але перейшов на напівлегальний статус і продовжував свою політичну діяльність у місцевій Думі та земській управі до їх розпуску в березні 1918 року. На ІІ Всеукраїнському з'їзді Рад у Катеринославі Ісаак Прохорович висловив критику щодо російсько-більшовицької окупації та заявив про відмову України від опіки московських комісарів, які вимагали підпорядкування українського народу.
  Після звільнення Катеринослава від більшовиків Ісаак Мазепа очолив Губерніальну Революційну Раду. Однак через складну політичну ситуацію ця установа існувала недовго. У жовтні 1918 року Ісаака Прохоровича заарештували, але через деякий час відпустили. У січні 1919 року його було обрано делегатом Конгресу трудового народу України.
  Особливо яскраво розкрився талант Ісаака Мазепи як організатора на посаді міністра внутрішніх справ Директорії, в уряді Бориса Мартоса. Незважаючи на тяжкий період в історії української держави того часу, органи МВС мали досить міцну матеріально-технічну базу, створену завдяки старанням Ісаака Мазепи. Немало зробив особисто міністр і для організації народної самооборони. У червні 1919 року Рада народних міністрів видала "Наказ про народну самооборону". Згідно з наказом, у кожному селі чи містечку організовувалися загони охорони, до складу яких входило все чоловіче населення. Сили самооборони охороняли населені пункти від злочинців, які грабували людей, а також боролися з ворожою агітацією, мали право затримувати всіх підозрілих осіб. Вони допомагали місцевій, повітовій та військовій владі запроваджувати в життя розпорядження уряду і вищого командування.
  Та, незважаючи на всі міністерські досягнення Ісаака Мазепи, справи Директорії складалися все гірше. Наказом Директорії Ісаака Прохоровича було призначено керівником уряду УНР. Одночасно він залишався і міністром внутрішніх справ. Прем'єрство Ісаака Мазепи, як зазначав П. Феденко, припало на складний час, коли "тільки непохитна, хтось скаже – романтична – віра утримувала тоді людей при уряді і в армії УНР, хоча були дні, коли більшовицька кіннота знаходилася в 25 кілометрах від тимчасової столиці УНР".
  15 листопада 1919 року Директорія фактично розпалася. Обов'язки прем'єра Ісаак Мазепа виконував до 26 травня 1920 року, після чого С. Петлюра висловив йому щиру подяку "за велику історичну працю" і доручив українському соціалісту-федералісту В. Прокоповичу сформувати новий уряд, у якому Ісаакові Мазепі була запропонована посада міністра землеробства. Втім, незгода з планами нового уряду щодо земельного питання змусила його 1 липня 1920 року відмовитися від цієї посади.
  Після закінчення своєї політичної кар'єри в листопаді 1920 року Ісаак Прохорович вирушив до Львова. Там він зайняв посаду в бібліотеці Наукового товариства імені Шевченка і продовжив свою активну громадську діяльність. Разом з П. Феденком та Й. Безпальком Ісаак Мазепа видавав і редагував щомісячник "Социалистическая мысль".
  У 1923 році Ісаак Прохорович переїхав до Праги (Чехословаччина), де активно долучився до роботи соціалістичного робітничого Інтернаціоналу. Він представляв українські інтереси на різних конгресах, де обстоював ідею створення незалежної та демократичної України.
  Ісаак Мазепа – професор Української господарської академії у Подєбрадах, Українського соціологічного інституту у Празі.
  З 1945 року Ісаак Прохорович мешкав в Австрії та Німеччині. У 1946 році він – професор Українського технічно-господарського інституту у Мюнхені (Баварія).
  Перебування у Чехословаччині та Німеччині було важким періодом у житті Ісаака Мазепи, насамперед під час Другої світової війни, коли під час бомбардування Праги він втратив дружину і двох онуків.
  Після переїзду до Німеччини Мазепа став активним у політичній сфері. Він заснував Українську Національну Раду на чужині і від 1948 року очолював виконавчий орган Ради. Одним із головних завдань було поширення інформації про Україну та захист українських інтересів. У 1950 році Ісаак Прохорович став засновником Української соціалістичної партії.
  Помер Ісаак Мазепа 18 березня 1952 року і похований в Аугсбурзі (Німеччина).
  Поряд з професійними виданнями вченого-агронома Ісаак Прохорович залишив цілу низку історичних і публіцистичних праць про національно-визвольну боротьбу українського народу часів Центральної Ради та Гетьманату. Серед них "Більшовизм і окупація України" (1922), "Підстави нашого відродження", "Україна в огні і бурі революції" (1941, 1952) та інші. У своїх творах Ісаак Мазепа вважав свободу передумовою розвитку кожного суспільства.